小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為原代培養(yǎng)細(xì)胞，其刺激增殖的能力強(qiáng)且可靠、易培養(yǎng)、來源豐富，常被用作干細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。一方面提供刺激干細(xì)胞增殖的各種因子，另一方面保持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。雖然MEF傳代次數(shù)有限，但可早期凍存一些，不斷復(fù)蘇，保持長期使用。MEF的缺點是無法耐受G418的篩選。替代方法是從持續(xù)表達(dá)neo抗性的小鼠品系或轉(zhuǎn)基因品系來分離培養(yǎng)MEF。利用各種轉(zhuǎn)基因鼠培養(yǎng)的MEF細(xì)胞還是各種基因功能研究的良好工具。

　　（一）材料

　　12.5~14.5d的小鼠胚胎(3~6只小鼠／次），培養(yǎng)皿（直徑10cm),DMEM+10%新生牛血清，15cm或50cm離心管（圓底），PBS配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手術(shù)刀、鑷子、剪子等器械。

　　（二）操作步驟

　　1.一般操作

　　(1)在培養(yǎng)皿中，解剖出鼠胚，以Hanks溶液消洗。

　　(2)除掉四肢、大腦及內(nèi)臟（肝臟）。

　　(3)用無菌Hanks溶液＋PBS漂洗3次。

　　(4)置培養(yǎng)皿中，用手術(shù)剪切碎。

　　(5)將剪碎組織移入50ml離心管中，加入約10ml消化液。

　　(6)37°C搖育10min（置水浴或孵育箱中）。

　　(7)吸5ml上清液放入另一50ml離心管中，加等體積含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和胰蛋白酶。

　　(8)再加入4ml消化液至原離心管（內(nèi)含組織），顛倒搖動，10min后再吸出5ml上清液到另一離心管中，加入5ml含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

　　(9)重復(fù)上一步驟5次左右，此時離心管中僅剩無法消化的軟骨等。

　　(10)離心50ml離心管，加50ml含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

　　(11)取適量移到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

　　(12)第二天換液，直到細(xì)胞長滿（匯合），1:10傳代，再生長至合適密度時可進(jìn)行凍存。

　　(13)根據(jù)實驗需要復(fù)蘇細(xì)胞，由于MEF細(xì)胞傳代數(shù)有限，實驗時應(yīng)盡可能保留相同代數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行平行實驗。

　　2.處理或γ-射線處理用作飼養(yǎng)層的MEF細(xì)胞還須進(jìn)行處理或干射線處理，步驟如下。

　　（1）處理

　　復(fù)蘇凍存的MEF細(xì)胞(5×104個/cm2，保證用時滿滿一層，不留空間。

　　匯合狀態(tài)下的MEF加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml絲裂霉紊的DMEM培養(yǎng)液，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3h。

　　以PBS漂洗數(shù)次，胰蛋白酶消化，以每分鐘1000轉(zhuǎn)的速率離心5min,收集沉淀，用新培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整濃度為3×105g個/ml。

　　將細(xì)胞接種于經(jīng)明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中。（明膠預(yù)處理：0.1％明膠溶液浸泡2h,移走多余的明膠，待自然干燥。）

　　(2)γ-射線處理

　　匯合狀態(tài)的MEF細(xì)胞，以30~100Gy的γ－射線處理。

　　胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，離心（每分鐘1000轉(zhuǎn)，10min)、計數(shù)，接種到明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中。Y-射線處理過的細(xì)胞也可以5×106個／ml的濃度凍存起來。復(fù)蘇后，1支凍存管可接種到4~5塊直徑6cm的培養(yǎng)皿中。